انتقال فیوژن دو ژنی (اینترفرون گامای انسانی- ژن مقاومت به علف کش (ژن بار)) به گیاه توتون

در دسترس بودن پروتئین های انسانی نوترکیب باعث تحول عظیمی در استفاده ی دارویی از پروتئین های ارزشمند در پزشکی بالینی شده است. تولید پروتئین اینترفرون گامای انسانی در سیستم های بیانی یوکاریوتی، به عنوان یک پروتئین نوترکیب درمانی، در مطالعات پزشکی اهمیت بسیاری دارد. اینترفرون گاما سایتوکین اصلی سیستم ایمنی می باشد. ویژگی های منحصر به فرد اینترفرون گاما، آن را به یک فاکتور ضد سرطانی مناسب تبدیل کرده است. از اینترفرون گامای نوترکیب به عنوان دارو در درمان سرطان و برخی بیماری های ویروسی استفاده می شود. فسفینوتریسین مهارکننده ی قوی گلوتامین سینتاز است و از گروه علف کش های غیرانتخابی می باشد. ژن bar کدکننده ی آنزیم فسفینوتریسین-n- استیل ترانسفراز است. این آنزیم باعث ایجاد مقاومت به علف کش فسفینوتریسین می شود، و به واسطه ی خصوصیات فیزیولوژیکی این آنزیم، حضور آن در گیاهان تراریخته پتانسیل پایینی به لحاظ سمیت و آلرژی زایی دارد. بنابراین ژن bar می تواند به عنوان یک نشانگر انتخابی (صفت مقاومت به علف کش) جهت غربالگری گونه های زیادی از گیاهان تراریخته استفاده شود. به دلیل نیاز روز افزون کشور به انواع پروتئین های نوترکیب با هزینه ای پایین و حجم انبوه، استفاده از روش های کم هزینه و قابل اعتمادی اعم از سیستم های بیانی گیاهی، ضروری می باشد. با توجه به ارزش دارویی پروتئین hifnγ و نیز اهمیت ژن گزینشگر bar، پژوهش حاضر با هدف انتقال فیوژن hinfγ-bar به گیاه توتون و در نهایت تولید پروتئین های اینترفرون گامای انسانی و فسفینوتریسین-n- استیل ترانسفراز نوترکیب در گیاه توتون انجام شد. جهت تراریختی گیاه، ناقل بیانی گیاهی pcambia 1305.1-hifnγ-bar با روش استاندارد انجماد و ذوب به اگروباکتریوم سویه ی lba4404 انتقال داده شد، و تراریختی باکتری از طریق تکنیک colony pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن hinfγ تایید شد. به منظور بیان موقت فیوژن hinfγ-bar به روش وکیوم اینفیلتریشن، اگروباکتریوم نوترکیب حامل فیوژن ژن های bar-hifnγ (تحت کنترل پیش برنده ی camv35s و خاتمه دهنده ی nos) به بافت برگ های تازه گیاه توتون رقم xanthi، تلقیح گردید. پس از تایید بیان پروتئین hinfγ-bar با استفاده از آنالیز دات بلات، اقدام به تولید گیاهان تراریخته ی دائم به روش دیسک برگی شد و گیاهچه های تراریخته ی احتمالی (t0) در محیط گزینشگر هیگرومایسین با غلظت 15 میلی گرم در لیتر انتخاب شدند. گیاهچه های تراریخته ی احتمالی پس از ریشه دار شدن به خاک منتقل شدند. تراریختی گیاهان باززایی شده با استفاده از تکنیک pcr تایید شد. در این پژوهش، حضور پروتئین hinfγ-bar با استفاده از آنالیزهای دات بلات، sds-page و وسترن ایمنوبلاتینگ شناسایی شد. گیاهان توتون تراریخته پس از انتقال به گلخانه، جهت تحمل به علف کش باستا با فرمول تجاری فسفینوتریسین، ارزیابی شدند. بررسی غلظت های مختلف (1000، 2000، و 4000 گرم ماده ی مؤثره در هکتار) از علف کش باستا نشان داد که گیاهان تراریخته ی مقاوم، تا غلظت 4000 گرم ماده ی مؤثره در هکتار فسفینوتریسین را به خوبی تحمل می نمایند. در تراریخته های حساس، تیمار علف کش منجر به کلروز و نکروز بافت و تأخیر رشد گیاه شد، و گیاهان غیر تراریخته از بین رفتند. تمام گیاهان تراریخته ی مقاوم به علف کش از نظر فنوتیپی نرمال بودند.